1 前言
在组织工程中，三维多孔支架为种植的细胞提供生物力学的支持，使细胞形成功能性的组织[1,2]。报告显示，除了基底的化学性质，支架的结构体系对组织的培养起着重要作用。
近年来，多孔支架的构建和发展在组织工程中的多种应用受到了广泛的关注[3-6]。
胶原是动物体内含量最丰富的蛋白质，属于不溶性纤维蛋白质，遍布于体内各种器官和组织，如皮肤、骨、软骨、肌腱、角膜等等。明胶（Gelatin. Gel），是胶原的部分变性衍生物，无抗原性，生物相容性好，可生物降解[7]。
甲壳素是一种天然高分子化合物，属于多糖。壳聚糖（Chitosan, CS）, 是甲壳素的脱乙酰化产物，是细胞外基质中糖胺聚糖结构类似物。壳聚糖是一种具有优良生物相容性的可降解材料，其在哺乳动物体内能被溶菌酶降解成氨基糖，氨基糖可以进入糖胺聚糖和糖蛋白的代谢循环，也可以排除体外。它还具有低抗原性、促进伤口愈合，抗菌等特性。此外壳聚糖是带正电荷的线性多糖，它可与带负电的生物大分子，如明胶形成聚电解质配合物。壳聚糖还具有较好的力学性能，而且易于加工成型。综合明胶和壳聚糖的优点，将壳聚糖和明胶复合制备多孔支架材料, 将能满足对支架材料的要求[8-10]。
目前，气管组织工程研究的方法是在体外的支架材料上培养气道平滑肌细胞(airwaysmooth muscle cell, ASMC )，形成有功能的组织。本实验研究在不同条件下制备壳聚糖-明胶三维支架的结构和性质，以及平滑肌细胞在支架中生长的状态，为筛选可作为气道组织工程研究用的材料奠定基础。
2 材料和方法明
明 胶（ Sigma Chemical Co. ） ； 壳聚糖（HaiHui Bioengineering Co. ） ； 溶菌酶（7000u/mg,Biosharp,Japan）；戊二醛(分析纯,成都科龙化工试剂)；醋酸（分析纯，成都科龙化工试剂）；DMEM/F-12 培养基（Hyclone, USA）；胎牛血清(Sigma, USA)；培养用三蒸水；细胞培养瓶及培养板（Costar，USA）；MTT（Sigma, USA）；FITC-Phalloidin（Sigma,USA）。
2.1 制备三维壳聚糖-明胶支架
实验选用的壳聚糖为精制壳聚糖。称取一定量的壳聚糖用1wt%的醋酸，在室温下溶解，然后在加入明胶（壳聚糖、明胶质量按1：1 比例），使明胶、壳聚糖充分混合溶解，配制成浓度为1、2、3wt%的混合溶液。将混合溶液分装到培养板，然后分别放入不同温度（-20℃，-80℃，-196℃）下预冻。预冻24 小时后，放入冷冻干燥机冻干24 小时。然后对材料进行（用0.25%戊二醛）交联处理，用硼氢化钠脱醛，用蒸馏水洗净后，二次冻干，将材料放入干燥器备用。
2.2 结构观察
用扫描电子显微镜（SEM，TESCAN VEGA ?? LMU）对支架的架构进行观察。在使用SEM 观察支架之前，先用液氮冷冻支架的表面和部分使之断裂,然后喷涂上金。支架孔的平均直径作为支架的有效孔径。随机选择每个样品的三个不同区域，至少选择20 个孔测量孔径。
2.3 孔隙度的测量
我们采用液体转化法来测量三维支架的孔隙度[11,12]。壳聚糖、明胶均不溶于正己烷，因此选用正己烷为转换剂。正己烷能渗透进入相互关联的支架孔中，所产生的膨胀和皱褶可以忽略不计。测量时，首先将支架浸入装有正己烷的量筒中5 分钟，原正己烷的体积记为（V1）。
支架浸入量筒后，原正己烷和支架的总体积记为（V2）。取出支架后，剩余的正己烷体积记为（V3）。支架的孔隙度ε 可以通过以下公式获得：ε（%）=（V1－V3）／(V2－V3) [13]。
2.4 大鼠气道平滑肌细胞的培养
本实验采用组织贴块法来制备大鼠气道平滑肌原代细胞[14]。然后对原代细胞进行传代，使用第3 代的平滑肌细胞。所用培养基为DMEM/F-12 和10%胎牛血清。将细胞培养在37℃，5%CO2 的条件下，每三天换一次液。当细胞爬满培养瓶的80-90%时，可用于实验。
2.5 细胞在壳聚糖-明胶三维支架中的增殖
将原代培养大鼠气道平滑肌细胞的第3 代，稀释到细胞浓度为2×104 个/ml。在装有三维支架的24 孔板中，每孔加入含有气道平滑肌细胞的培养基500μl。培养到1、3、6d 分别用MTT 法检验细胞的活性。每孔加入100μlMTT（5mg/ml），在37℃，5%CO2 的培养箱中培养4h。吸去孔内上清液，每孔加入500μl 二甲基亚砜（DMSO）溶解转化的染料。再从每孔取出100μl 溶液转移到96 孔板，用酶标仪测定490nm 处溶液的OD 值[15]。
2.6 免疫荧光染色
将细胞种植于三维支架材料上以后，选择适当的时间，对细胞骨架进行染色。实验步骤：
吸弃培养板中的培养液；用磷酸盐缓冲液（PBS）清洗细胞2 次，每次10 分钟；4%的多聚甲醛固定20 分钟，用PBS 清洗细胞2 次；0.1%Triton X-100/PBS 室温破膜5 分钟，PBS
